公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷！

NHS-Activated Magnetic Beads 是均勻的，表面覆蓋有高密度NHS（N-羥基琥珀 酰亞胺） 官能團的磁珠。磁珠通過形成穩(wěn)定的酰胺鍵方式，快速、高效的共價結合任何含有伯胺的配 體(圖 1）。本款磁珠可以在偶聯條件下快速完成反應（室溫 pH 6.5-9 下 15-30 分 鐘，4℃ 下 4 小時），且不需要危險化學品。 NHS-activated Magnetic Beads 適于結合大分子蛋白。 Long-arm NHS-activated Magnetic Beads 被推薦用于結合小肽分子， 因為其長臂（21-原子） 的親水連接基團可以減少位阻現象。 NHS-activated Magnetic Beads 可以地作為親和樹脂進行親和純化，將分子、 細胞和 部分細胞提取物進行提煉純化。在與配體結合后，將磁珠添加到含有目標分子的樣品中，然 后混合、孵育、洗滌和洗脫目標分子（圖2）。

產品特點及優(yōu)勢：

·預活化即用型磁珠

·便于使用

·在pH7.4，4℃-25℃條件下可以快速偶聯

·穩(wěn)定的共價鍵，低水平的配體泄漏

·可重復使用的免疫親和基質

·極低的非特異性結合率

·用途：用于純化抗體，蛋白質/肽，DNA / RNA;細胞篩選、免疫沉淀

操作步驟

提示：

強烈建議在實驗過程中進行滴定優(yōu)化，以確定每個實驗中應用的磁珠數量。該協議可以相應地放大和縮小。避免使用含有 tris 或其他含有伯胺類試劑的緩沖液，因為它們與預期的偶聯反應競爭。

1.將適量的珠子轉移到離心管中。將管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當磁珠沉淀時， 去除上清液。 

2.取下試管，加入 5 倍磁珠溶液體積的 PBS 緩沖液，通過震蕩重新懸浮磁珠，渦旋 30 秒。將試管至于室溫環(huán)境 1-3 分鐘，再將管放在磁力分離器上 1-3 分鐘。當磁珠沉淀 時，去除上清液。 

3.重復步驟 2 兩次。 

4.向含有目標蛋白質的粗樣品中添加洗滌過的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴 1-2 小時 （溫度越低，培養(yǎng)時間越長）。提示：強烈建議進行滴定實驗以優(yōu)化培養(yǎng)時間。因為孵化 的時間太長可能會導致很高的背景。 

5.用 5 倍磁珠體積的 PBS 緩沖液或 1M NaCl 清洗磁珠，直到 280nm 處洗脫液的吸 光度接近背景水平（OD 280<0.05）。提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也 可能會降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加 NaCl（濃度為 1-1.5 M）、0.1-0.5% 的非離子洗滌劑，如 TritonX-100 或 Tween-20，以及還原劑，如 DTT 或 TCEP（我們通 常使用 3mM）。 6.通過適當的方法，如低 pH（2-4）、高 pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或 SDS-PAGE 上樣緩沖液中煮沸，洗脫目標蛋白。

PCR 反應需要使用哪些試劑和設備？

試劑:
模板DNA：PCR反應需要模板DNA，如從細胞、組織、血液中提取DNA等；引物：PCR反應的兩個引物，分別與模板DNA的兩端配對擴增所需的特定區(qū)域，引物也可以合成為TA克隆等過程中使用到的引物；dNTPs：PCR反應中需要四種dNTPs，包括脫氧腺苷酸（dATP）、脫氧胸苷酸（dCTP）、脫氧鳥苷酸（dGTP）、脫氧胞嘧啶酸（dTTP），用于細胞分裂、DNA合成等生物學過程，用于PCR擴增的模板DNA鏈的延伸和擴增；Taq DNA聚合酶：PCR反應需要的聚合酶，一般使用Taq聚合酶，還有一些其他種類的聚合酶如PFU、Phusion等，用于擴增DNA鏈；PCR buffer溶液：對PCR反應具有緩沖作用，調節(jié)反應pH，硫代硫酸氫鹽SDS、小分子有機化合物如甲醛，可增強PCR反應特異性，從而提高反應效率；酶切體系：PCR擴增往往涉及到重組、構建和測序等等實驗步驟，常常需要進行酶切操作。MARK:一種分子量標準，用來判別DNA片段大小的工具。DNA純化試劑盒：用于純化PCR反應產物；
設備：
PCR儀：用于控制反應溫度，保證PCR反應時不同溫度環(huán)節(jié)的嚴格控制；電泳槽：用于分離PCR擴增產物；核酸提取儀：從組織樣本中全自動提取核酸。  這些試劑和設備在PCR分子生物學技術中均是，只有在有序齊全的基礎上，才能進行PCR反應并得出準確結果。

PCR相關基礎實驗：

PCR反應基本步驟一般的聚合酶鏈式反應由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：

一、變性：

利用高溫（93-98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘，接下來PCR儀就控制溫度進入循環(huán)階段。

二、退火或稱接合,復性：

在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導致引物不與模板結合或者錯誤地結合。該步驟時間1-2分鐘。

三、延伸：

DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000bp/min、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。

PCR反應條件優(yōu)化：

1、變性溫度和時間：

保證模板DNA解鏈是保證整個PCR擴增成功的關鍵。加熱90~95°C, 30~60s，再復雜的DNA 分子也可變性為單鏈。溫度過高或高溫持續(xù)時間過長，可對Taq酶活性和dNTP分子造成損害。

2、復性溫度和時間:

PCR擴增特異性取決于復性過程中引物與模板的結合。復性溫度越高，產物特異性越高。復性溫度越低，產物特異性越低。需根據引物的Tm值具體設定。

3、延伸溫度和時間:

一般位于Taq酶最適作用溫度70~75°C之間。引物小于16個核苷酸時，過高的延伸溫度不利于引物與模板的結合，可以緩慢升溫到70~75°C。延伸反應時間，可根據待擴增片段的長度而定，小于1kb, 1min足夠；大于1kb需加長延伸時間。Taq酶可根據1kb/min增加時間。這里需要注意，延伸時間過長可能出現非特異擴增。因此需要設置恰到好處的延伸時間。

4、循環(huán)數:

其他參數選定后，PCR循環(huán)次數主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20?25次循環(huán)后，PCR產物的積累即可達到最大值，實際操作中由于每步反應的產率不可能達到100%，因此不管模板濃度是多少，20~30次是比較合理的循環(huán)次數。循環(huán)次數越多，非特異擴增增加。

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